本文目次一览：
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1、eve海燕如何配
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2、对于高尔基的海燕
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3、EVE菜鸟就教海燕级的舰载各种装备
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4、原核体系中影响外源基因表白功率的主要因素？
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5、广东产业年夜学研究生导师张海燕如何样
eve海燕如何配
海燕很蛋疼
他是磁轨炮渠道
而C族年夜局部都是玩导弹的
以是海燕还是比拟合适打捞
要是你非要玩的话
[海燕级, 新的装置 1 仿造 1]
侵害操控 II
小型护盾回充增量器 II
光子散射式力场 II
热发散力场 II
中型护盾扩大设置装备摆设 II
125mm磁轨炮 I, 反物质轨迹弹 S
125mm磁轨炮 I, 反物质轨迹弹 S
125mm磁轨炮 I, 反物质轨迹弹 S
125mm磁轨炮 I, 反物质轨迹弹 S
125mm磁轨炮 I, 反物质轨迹弹 S
125mm磁轨炮 I, 反物质轨迹弹 S
[空的高槽位 ]
[空的高槽位 ]
[空的改装槽位 ]
[空的改装槽位 ]
[空的改装槽位 ]
你太难为我了
对于高尔基的海燕
期间背景：
1901年11月7日那天，尼日尼·诺夫戈罗德的人们很早就把火车站挤满了，他们是为了给本人喜好的作家高尔基送别。沙皇当局此次破天荒的未经鞠问就急急忙的把高尔基流放到库尔斯克去。高尔基刚到来，人群中就爆发出了“高尔基万岁”、“打垮专制轨制”、“打消乌黑气力”的呼声。请愿者时而高唱变革歌曲，时而朗读《海燕》。一位演说者高声说道：“高尔基被流放了，起因是他说出了真谛并戳穿海燕aaii外呼体系我们日子中可骇的功课。他有一件武器——他的笔，一种力量——他那在自由颁布发表定见时所表明的思想……我们要用请愿来表明我们是如何的喜好高尔基。” 请愿终了后，一位年夜先生冲动的高呼：“暴君即将去世，而巨年夜的无利的自由的百姓即将兴起海燕aaii外呼体系！”就因为他的一篇短短的散文诗——《海燕》。
海燕的写作背景：
高尔基写这首诗是在1901年俄国榜首次年夜变革的前夕，当时百姓公共的变革静止风起云涌，沙皇抵拒当局加紧了对百姓的打压，恰是变革与反变革猛烈斗争的时候。高尔基当时在彼得堡，亲自感到到了工人静止、先生静止的彭湃气魄，目睹了沙皇当局打压先生静止的残暴罪恶。他为了热心肠歌颂无产阶层变革先驱，戳穿沙皇抵拒当局，冲击机会主义者、资产阶层自由派的丑陋嘴脸，就写下了《海燕》这篇散文诗。
参考材料：
全文与经典句子：
最经典的句子 ——让狂风雨来得更剧烈些吧
高尔基《海燕》
在苍茫的年夜海上，狂风卷集着乌云。在乌云和年夜海之间，海燕像玄色的闪电，在高傲的飞翔。
一霎时党羽碰到波涛，一霎时箭普通地直冲向乌云，它叫唤着，——就在这鸟儿勇敢的叫唤声里，乌云听出了欢欣。
在这叫唤声里——充满着对狂风雨的渴望！在这叫唤声里，乌云听出了仇恨的力量、热心的火焰和乐成的决计。
海鸥在狂风雨来临之前太息着，——太息着，它们在年夜海上飞窜，想把本人对狂风雨的惶恐，掩藏到年夜海深处。
海鸭也在太息着，——它们这些海鸭啊，享用不了日子的战斗的欢欣：霹雳隆的雷声就把它们吓坏了。
蠢笨的企鹅，害怕地把瘦弱的身材藏匿到山崖底下……只需那高傲的海燕，勇敢地，自由自由的，在出现白沫的年夜海上飞翔！
乌云越来越暗，越来越低，向海面直压上去，而波涛一边歌颂，一边冲向地面，去迎候那雷声。
雷声轰响。波涛在仇恨的飞沫中呼唤，跟狂风争鸣。看吧，狂风牢牢抱起一层层巨浪，恶狠狠地把它们甩到山崖上，把这些年夜块的翡翠摔成尘雾和碎末。
海燕叫唤着，飞翔着，像玄色的闪电，箭普通地穿过乌云，党羽掠起波涛的飞沫。
看吧，它飞翔着，像个精灵，——高傲的、玄色的狂风雨的精灵，——它在年夜笑，它又在叫唤……它笑些乌云，它因为欢欣而叫唤！
这个活络的精灵，——它从雷声的震怒里，早就听出了疲惫，它深信，乌云遮不住太阳，——是的，遮不住的！
狂风吼叫……雷声轰响……
一堆堆乌云，像青色的火焰，在无底在年夜海上燃烧。年夜海抓住闪电的箭光，把它们停息在本人的深渊里。这些闪电的影子，活像一条条火蛇，在年夜海里蜿蜒游动，一晃就隐没了。
——狂风雨！狂风雨就要来啦！
这是勇敢的海燕，在吼怒的年夜海上，在闪电核心，高傲的飞翔；这是乐成的先知在叫唤：
——让狂风雨来得更剧烈些吧
海燕》课时教诲计划
教诲目标：
1、理解作家及无关背景。
2、在朗读的基础上体会著述的深切内涵。
3、理解标记、对比等举措在文中的使用。
4、培育种植提拔勇敢、刚烈、达不雅、自信的品质和生动的人生立场。
教诲要点：
在朗读的基础上体会著述的深切内涵。
教诲难点：
标记举措的理解。
教诲方法：
朗读—品味—根究法
教诲历程：
一、景遇导入（打出海燕图片，合作热心音乐）
导语：看，在狂风雨来临之前，海燕在苍茫的年夜海上高傲地飞翔，它们被称为“乐成的预言者”。昔日我们进修散文诗《海燕》，感到高尔基给我们带来的剧烈的生命之音。（揭题、齐读）
二、揭示进修目标：（教员理解读）
1、理解作家及无关背景。
2、在朗读的基础上体会著述的深切内涵。
3、理解标记、对比等举措在文中的使用。
4、培育种植提拔勇敢、刚烈、达不雅、自信的品质和生动的人生立场。
三、作者简介：
1、 先生相同课外收集的无关作者高尔基的材料。
2、 师生一路清楚作者的主要材料。（幻灯片浮现）。
四、背景引见（幻灯浮现）
请一位先生朗读背景引见，一路清楚，为更好地理解全文的内涵办事。
五、朗读操练：
1、 听伴奏朗读，先生可随着读，激发先生的朗读欲望。
2、 自由读，可能选本人最感乐趣的、最善于的一段或几段来朗读。
3、 抽几位同窗停止阶段朗读比赛（伴奏，提高生动性，营造热心氛围。）
4、 点评、夸奖。
六、分解海燕的抽象
导语：经由朗读，同窗们面前肯定出现了海燕的抽象，假设在海燕之前填上一个润色语，海燕aaii外呼体系你会填什么呢海燕aaii外呼体系？（先生凭本人的理解，各抒已见，教员应赐与实时的肯定与鼓励，教员适时板书）（幻灯浮现根究一）。
七、分解本文的写作举措：
成绩计划：海燕的精神在文中是如何表现进去的？（根究二）（适时板书）
详细操纵：1、先生自由回答。教员讲到对比举措时可让先生朗读无关描述海鸥等的句子来加以体会，可计划“海燕的宣言”。
2、标记举措要作为一个要点详细帮助先生理解，因为有肯定难度，可思索用连线题。幻灯用超等链接的举措联合后面的期间背景进一步帮助理解本文的标记意义。
八、朗读全文（伴奏）
九、课内涵伸（小练笔）
在每团体的日子中，都既有温暖的爱的阳光照耀，也有百般百般的“狂风雨”检测。面临日子的狂风雨，你该如何做呢？就这个话题写一篇短文。
板书计划：
对比
衬托
（ ）的海燕 反复
勇敢 高傲 拟人
自信 刚烈 譬喻
充满斗志 标记
年夜无谓
坚韧不拔
参考材料：根据网络收集
回答者：hegq - 经理 四级 1-27 13:06
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《海燕》又叫《海燕之歌》，是前苏联作家高尔基高尔基1901年3月写的一篇带有标记意义的短篇小说春天的旋律的完毕一章。但厥后单独颁布发表，成为广为传抄，极受欢送的出名的散文诗。当时的俄国社会受着沙皇的专制操控，社会乌黑，水深火热。百姓的变革静止也越来越低落，高尔基亲自目睹了经历了当时的公共变革静止，以是联合当时的变革斗争场面地步，写出了《海燕》，用标记的举措，召唤百姓停止变革斗争和迎候变革狂风雨的来临。这首散文诗也深受列宁、斯年夜林的观赏，被称为“战斗的变革诗篇”。
这首散文诗是使用标记举措获得巨年夜乐成的范例。标记举措，类似譬喻，但又不象譬喻那样开宗明义地“以彼物比此物”，它是经由强化标记体的实质特性，蜿蜒地表现与之类似的人与事，情与理。高尔基说：“在标记上面，可能奇奥地把讽刺和大胆的语言遮蔽起来，在标记中，可能注入很多的思想内容。”在诗中，作者由海燕在狂风雨来临前象“玄色的闪电”高傲飞翔，标记无产阶层变革士兵在变革到来之际的战斗风味和变革达不雅主义精神；别的，乌云标记沙皇的抵拒操控，年夜海标记广大公共，海鸥、海鸭、企鹅则标记形形色色的害怕变革的人，狂风雨标记颠覆沙皇抵拒政权的变革静止。散文诗使用标记举措，每每是通篇的使用，而不是某个句子的标记意思。在诗中，作者用标记举措构想全文，把全部组成一幅残缺的画面，让它们分别标记斗争的场面地步、情况和种种力量，表现了在1905年俄国变革前夕的社会景象，预示了无产阶层变革风暴的到来。
这首散文诗另有一个特性即是对比和衬托举措的奇奥使用。在诗中，为了表现海燕的勇敢、达不雅和对狂风雨的渴望，除了对海燕作间接描述外，还经由狂风雨来临前夜年夜海海面改变的描述来衬托，并以海鸥、海鸭、企鹅等来作对比。榜首局部写海鸥、海鸭、企鹅的太息、飞窜、惶恐、藏匿与海燕那高傲的飞翔，欢欣的叫唤组成光鲜明显的对比，无力地出色了海燕的勇敢、达不雅。第二局部写波涛与狂风生死斗争的鏖战场合排场，恰是以富丽背景来衬托海燕的战斗雄姿。第三局部写风、云、雷、电一齐出动，以此背景来衬托海燕那战斗召唤的奔放高昂，抖擞民气。
这首散文诗的第三个特点是语言上具备剧烈抒怀性。作为散文诗，《海燕》的句子不分行，但它简练、抽象、斑斓，有肯定的跳动性，节拍感强。比方“海燕叫唤着、飞翔着，像玄色的闪电，箭普通地穿过乌云，党羽掠起波涛的飞沫”，短短一句，以“叫唤”写声，以“玄色的闪电”写形，以“飞翔”“穿过乌云”“掠起波涛的飞沫”写连续串的疾速活络的活动；有譬喻、有夸张(“箭普通地”，譬喻中兼有夸张)，抽象特性光鲜明显；较多的句中中断加强了语言的节拍感，琅琅上口。全诗语言充满热心，使人抖擞，如完毕“让狂风雨来得更剧烈些吧!”既是期盼，呼唤变革的风暴，又是对百姓的战斗召唤。譬喻、夸张、拟人(如“年夜海抓住闪电的箭光，把它们停息在本人的深渊里”)、排比、反复等修辞举措的使用，使语言斑斓而有气魄，加强了表白结果。
《海燕》既是一首色调光鲜明显的抒怀诗，又是一幅赋有音乐的节律和活动感的油画，具备诗的音乐美和绘画美，给人很强的艺术感化力。
《海燕》为我们创造了“海燕”的艺术抽象，为无产阶层唱出了一曲充满战斗热心的颂歌。
英文版：
On boundless sea, strong winds volume collection dark cloud. Between the dark cloud and the sea, the petrel likes the black the lightning, in arrogant soaring.
A while wing is bumping the wave, a while arrow generally direct impact to the dark cloud, it is yelling, - - on in this bird brave sound, the dark cloud listened to be happy.
Is filling in this sound to the storm hope! In this sound, the dark cloud listened to the angry strength, the warm flame and the victory confidence.
Before the sea gull approaches in the storm is groaning, - - is groaning, they fly on the sea flee, wants oneself to the storm the fear, to hide to the sea deep place.
The auk also is groaning, - - their these auks, could not enjoy the life fight happiness: The bang rumble thunderclap scared them.
The stupid penguin, timidly hides the obese body to the cliff under... ... Only then that arrogant petrel, bravely, free, in exudes the foam on the sea to soar!
Dark cloud more and more dark, is more and more low, straight presses down to the sea level, but one side the wave sings, at the same time fires into the upper air, greets that thunderclap.
Thunderclap thunder. The wave calls in the angry priming, contends with the strong winds. Looks, the strong winds closely hold layer upon layer very rough sea waves, wickedly flings them to the cliff on, falls these bulks jadeites the dust and fog and the powder dust.
The petrel is yelling, is soaring, likes the black the lightning, the arrow passed through the dark cloud generally, the wing plunders the wave the priming.
Looks, it is dancing in the air, likes a demon, - - is arrogant, the black storm demon, - - it is laughing, it also is yelling... ... It smiles a dark cloud, it because of is happy but yells!
This sensitive demon, - - it from thunderclap being furious, already listened to be tired, it deeply believed, the dark cloud could not block from the sun, - - was, could not block from!
The strong winds roar... ... Thunderclap thunder... ...
Pile of dark clouds, like the green the flame, in bottomless burns on the sea. The sea holds the lightning the arrow light, extinguishes them in own abyss. These lightnings shadows, a live image strip fire snake, winds in the sea to hover, as soon as shook vanishes.
Storm! The storm must come!
This is the brave petrel, in roars on sea, among lightning, arrogant soaring; This is the victory prophet is yelling:
Lets the storm come more violent!
破折号：
1） 一霎时党羽碰到波涛，一霎时箭普通地直冲向乌云，它叫唤着，——就在这鸟儿勇敢的叫唤声里，乌云听出了欢欣。
破折号后面的内容写海燕飞翔的姿态，后边的内容则写乌云。从句法上分解，“就在这鸟儿勇敢的叫唤声里”是一偏正词组，用来润色后边的“乌云听出了欢欣”。光鲜明显这儿的破折号表明意思的转化。
2） 在这叫唤声里——充满着对狂风雨的渴望！
在这叫唤声里，海燕毕竟如何样，此处没有描述，以是这儿的破折号表明意思的中断。
（3） 海鸥在狂风雨来临之前太息着，——太息着，它们在年夜海上飞窜，想把本人对狂风雨的惶恐，掩藏到年夜海深处。
破折号前后都有“太息着”，表明意思的反复和跃进。
4） 海鸭也在太息着，——它们这些海鸭啊，享用不了日子的战斗的欢欣：霹雳隆的雷声就把它们吓坏了。
由对海鸭的描述转到对海鸭的议论，破折号表明意思的转化，一路还起舒缓口吻的结果。
（5） 看吧，它飞翔着，像个精灵，——高傲的、玄色的狂风雨的精灵，——它在年夜笑，它又在叫唤……它笑那些乌云，它因为欢欣而叫唤！
“榜首个破折号表明追加正文，出色海燕的实质特性。第二个破折号表明意思的廷伸和跃进，海燕从‘叫唤’到‘年夜笑’‘叫唤’，更浮现它的变革的达不雅和年夜无畏的气慨。”（教参）这儿的“追加正文”，实际上即是讲解说明。
6） 这个活络的精灵，——它从雷声的震怒里，早就听出了疲惫，它深信，乌云遮不注太阳，——是的，遮不注的！
榜首个破折号表明提醒下文；第二个破折号表明偏重，浮现海燕对变革必胜的决计。
（7）——狂风雨！狂风雨就要来啦！
这是海燕的战斗的号令，破折号相称于引号，引人注目。
（8）——让狂风雨来得更剧烈些吧！
这儿的破折号一方面相称于引号，另一方面起到总结全文的结果。
海燕所标记的人物：
高尔基写的《海燕》是一篇有巨年夜影响的散文诗。这篇出名的著述，经由对海燕在狂风雨即将来临之际勇敢欢欣的抽象描述，深切反应了1905年俄国变革前夜急剧发展的变革场面地步，热心肠歌颂了俄国无产阶层变革先驱者刚烈无畏的战斗精神，预言沙皇的乌黑操控必将崩溃，预示无产阶层变革即将到来并肯定获得乐成的前景，召唤广大休息百姓生动活动起来，迎候巨年夜的变革斗争。因此，它被称为迎候变革风暴的“战斗的变革诗篇”。
年夜海波涛标记变革低潮时的广大百姓公共的力量；狂风雨标记着囊括全部的变革海潮风暴；海燕标记勇敢善战的无产阶层变革的先驱者；海鸥、海鸭、企鹅标记害怕变革会败坏他们的愉逸窝的形形色色的假变革和不变革者。
EVE菜鸟就教海燕级的舰载各种装备
以下是EVEwiki里边间接粘帖过去的。很实在的一句话即是，驱逐舰是一款过渡性的战舰,很快就可能间接开巡洋舰.尤其是海燕，最出色的个性觉得即是配成打捞船。
舰船装备实例[修正]小行星带扫海盗打捞
高槽：1*劲弩火箭发射器I ，1*小型牵引光束 I ,1*打捞器 I,5*200mm轻型侦察员被动加农炮 I
中槽：1*定量型1MN加力燃烧器 I ，3*电容回充器I
低槽：1*反转平稳器 II
说明：中槽可能把电容回充器换成考古和分解的，本舰船可趁便迷信分解考古才干，其它之以是选射弹炮的长处即是他不费电。
[修正]PVE
高槽：7*125mm磁轨炮
中槽：1*小型能量护盾回充增量器,1*自愿抗盾,1*电容回充器（C族不用配）,1*1MN加力燃烧器
低槽：1*能源确诊
船体插件:
说明：这是个需要技术不高的装备，合适老手用来做一级任务.
驱逐舰是一款过渡性的战舰,很快就可能间接开巡洋舰.
[修正]PVE
高槽：4*250MM榴弹炮，1*马库斯标准导弹发射器，1*平面炸弹，1*打捞，1*牵引
中槽：1*小型能量护盾增量器,2*自愿抗盾,1*1MN加力燃烧器
低槽：1*能源确诊
船体插件:无
说明：这个装备做1级任务。16KM-8KM内的怪底子可能秒杀，比混淆炮的功率高多了，8KM-3KM之间的用导弹处置惩罚，3KM以内的间接用炸弹炸，功率不是普通的高，而且节俭弹药，一路可能打捞。之以是遴选射弹炮，是因为射弹炮不必耗电，以是电是满足的。固然，这个仅仅供应个思绪给我们，详细如何配要看我们的喜欢。
0.4地区装备
高槽：5*150mm高斯磁轨炮,2打捞扫描仪,1略能
中槽：1*清澈小型能量护盾增量器,1*小扩,1*护盾再生器,1*1MN加力燃烧器
低槽：1*回响反映堆操控
[修正]PVE
新人说本人的装备：
高槽：150mm磁轨*3，125mm磁轨*2，标导*1，极速炮*2
中槽低槽同上
配好相应炮弹，35KM锁上了就能打（实在最远能打40+我按驱逐无加成确认间隔说的），怪飞进20KM内，125炮跟导弹停战，底子上冲不进10KM内，好不容易出去两个，极速炮还等着呢，功率很高。这个配法的长处是不管离多远，都打的省心。缺点是稍微火力贫乏，但是1级任务的怪，也就多两炮的事。 剧烈倡议新人用驱逐打1级，比保护省心多了，本人试玩的驱逐，就没任务里爆过。
原核体系中影响外源基因表白功率的主要因素？
影响用意基因在年夜肠杆菌中表白的因素？ 浏览次数：904次赏格分：0 | 提问时辰：2009-4-28 17:30 | 提问者：lys2126
影响用意基因在年夜肠杆菌中表白的因素？
推荐谜底 ⑴外源基因的复制数
⑵ 外源基因的表白功率
①启动子的强弱
②核糖体接合位点的有效性
③SD序列和初步密码ATG的间隔
④密码子构成
⑶表白产物的平稳性
⑷细胞代谢负荷
⑸工程菌的培育种植提拔条件
计划构建一个载体，将用意基因在动物根系表白并向根细胞外渗出。请详细写出个进程 浏览次数：842次赏格分：20 | 处置惩罚时辰：2009-2-14 09:13 | 提问者：370629225
考研的 成绩
最佳谜底 先给你贴个器械你先看一下 但愿对你有帮助
将特定的外源基因构建在动物表白载体中并转入受体动物，并不是动物遗传转化的毕竟用意。志向的转基因动物每每需要外源基因在特定部位和特按时刻内高程度表白，产生人们但愿的表型性状。然则，近二十年的发展前史却表明，外源基因在受体动物内每每会出现表白功率低、表白产物不平稳以致基因失活或默然平静等不良景象，招致转基因动物无奈投入实际使用。其它，转基因动物的平安性成绩已在很多国度惹起人们的重视，比方，转基因有大概随花粉疏散，抗生素遴选标记基因有大概使临床上的某些抗生素失失结果等等。以上成绩的出现使得动物基因工程这一高新技术正处于一种前所未有的困扰期间。针对这些成绩，近几年人们对动物转基因技术停止了多方面的探索和改进，动物表白载体的改进和优化即是其间最紧张的一项内容，本文就现已获得的发展停止总述。
1 启动子的选用和改革
外源基因表白量贫乏每每是得不到志向的转基因动物的紧张起因。因为启动子在决定基因表白方面起要害结果，因此，遴选合适的动物启动子和改进其活性是加强外源基因表白主要要思索的成绩。
此刻在动物表白载体中宽泛使用的启动子是构成型启动子，比方，绝年夜多数双子叶转基因动物均使用CaMV35S启动子，票据叶转基因动物主要使用来自玉米的Ubiquitin启动子和来自水稻的Actinl启动子。在这些构成型表白启动子的操控下，外源基因在转基因动物的所有部位和所有的发育阶段城市表白。然则，外源基因在受体动物内持续、高效的表白不但构成摧残浪费蹂躏，每每还会惹起动物的形态产生改变，影响动物的生长发育。为了使外源基因在动物体内有效阐扬结果，一路又可增添对动物的倒霉影响，此刻人们对特异表白启动子的研究和使用越来越重视。已发明的特同性启动子主要包括器官特同性启动子和诱导特同性启动子。比方，种子特同性启动子、果实特同性启动子、叶肉细胞特同性启动子、根特同性启动子、侵害诱导特同性启动子、化学诱导特同性启动子、光诱导特同性启动子、热激诱导特同性启动子等。这些特同性启动子的克隆和使用为在动物中特同性地表白外源基因奠基了基础。比方，瑞士CIBA-GEIGY公司使用PR-IA启动子操控转基因烟草中Bt毒卵白基因的表白，因为该启动子可受水杨酸及其衍生物诱导，经由喷酒便宜、无公害的化学物质，诱导抗虫基因在虫灾重产生季节表白，光鲜明显是一个非常有效的路子。
在动物转基因研究中，使用人造的启动子每每不克不及获得令人满足的效果，尤其是在停止特异表白和诱导表白时，表白程度年夜多不可志向。对现有启动子停止改革，构建复合式启动子将是非常紧张的路子。比方，Ni等人将章鱼碱构成酶基因启动子的转录激活区与甘露碱构成酶基因启动子组成了复合启动子，GUS表白效果表明：改革后的启动子活性比35S启动子光鲜明显提高。吴瑞等人将操纵诱导型的PI-II基因启动子与水稻Actinl基因内含子1停止组合，旧式启动子的表白活性提高了近10倍（专利）。在动物基因工程研究中，这些人工构成的启动子阐扬了紧张结果。
2 加强翻译功率
为了加强外源基因的翻译功率，构建载体时普通要对基因停止润色，主要思索三方面内容：
2.1减少5‘-3‘-非翻译序列
很多实验现已发明，真核基因的5‘-3‘-非翻译序列（UTR）对基因的失常表白是非常须要的，该区段的缺变态会招致mRNA的平稳性和翻译程度光鲜明显降落。比方，在烟草花叶病毒（TMV）的126kDa卵白基因翻译初步位点下游，有一个由68bp核苷酸构成的Ω元件，这一元件为核糖体供应了新的联合位点，能使Gus基因的翻译活性提高数十倍。此刻已有很多载体中外源基因的5‘-端减少了Ω翻译加强序列。Ingelbrecht等曾对多种基因的 3‘-端序列停止过研究，发明章鱼碱构成酶基因的3‘-端序列能使NPTII基因的霎时表白提高20倍以上。其它，差别基因的3‘-端序列增长基因表白的功率有所差别，比方，rbcS3‘-端序列对基因表白的促成结果比查尔酮合酶基因的3‘-端序列高60倍。
2.2 优化初步密码周边序列
虽然初步密码子在生物界是通用的，然则，从差别生物来源的基因各有其特地的初步密码周边序列。比方，动物初步密码子周边序列的典范特性是AACCAUGC,植物初步密码子周边序列为CACCAUG，原核生物的则与二者差别较年夜。Kozak详细研究过初步密码子ATG周边碱基定点骤变后对转录和翻译所构成的影响，并总结出在真核生物中，初步密码子周边序列为ACCATGG时转录和翻译功率最高，特地是-3位的A对翻译功率非常紧张。该序列被前人称为Kozak序列，并被使用于表白载体的构建中。比方，有一个细菌的几丁质酶基因，原本的初步密码周边序列为UUUAUGG，当被润色为ACCAUGG，其在烟草中的表白程度提高了8倍。因此，使用非动物来源的基因构建表白载体时，应根据动物初步密码子周边序列的特性加以润色改革。
2.3对基因编码区加以改革
假设外源基因是来自于原核生物，因为表白机制的差别，这些基因在动物体内每每表白程度很低，比方，来自于苏云金芽孢杆菌的家养型杀虫卵白基因在动物中的表白量非常低，研究发明这是因为原核基因与动物基因的差别构成了mRNA平稳性降落。美国Monsanto公司Perlak等人在不改变毒卵白氨基酸序列的条件下，对杀虫卵白基因停止了改革，选用动物偏疼的密码子，减少了GC含量，去除原序列下影响mRNA平稳的元件，效果在转基因植株中毒卵白的表白量减少了30～100倍，获得了光鲜明显的抗虫结果。
3 打消方位效应
当外源基因被移人受体动物中之后，它在差别的转基因植株中的表白程度每每有很年夜差别。这主要是因为外源基因在受体动物的基因组内刺进位点差别构成的。这即是所谓的"方位效应"。为了打消方位效应，使外源基因都可能整合在动物基因组的转录生动区，在此刻的表白载体构建策略中普通会思索到核基质联合区以及定点整合技术的使用。
核基质联合区（matrix association region,MAR）是存在于真核细胞染色质中的一段与核基质特异联合的DNA序列。普通认为，MAR序列坐落转录生动的DNA环状布局哉的边界，其服从是构成一种切割结果，使每个转录单位保持绝对的自力性，免受四周染色质的影响。无关研究表明，将MAR置于用意基因的双方，构建成包括MAR-gene-MAR布局的动物表白载体，用于遗传转化，能光鲜明显提高用意基因的表白程度，降落差别转基因植株之间用意基因表白程度的差别，增添方位效应。比方，Allen等人研究了异源MAR（来自酵母）和同源MAR（来自烟草）对Gus基因在烟草中表白的影响，发明酵母的MAR能使转基因表白水平均匀提高12倍，而烟草本身的MAR能使转基因的表白水平均匀提高60倍。使用来源于鸡溶菌酶基因的MAR也可起到雷同结果。
另一可行的路子是选用定点整合技术，这一技术的主要道理是，当转化载体含有与寄主染色体同源的DNA片断时，外源基因可能经由同源重组定点整合于染色体的特定部位。实际操纵时主要要分别染色体转录活性地区的DNA片断，而后构建动物表白载体。在微生物的遗传操纵中，同源重组定点整合已成为一项老例技术，在植物中外源基因的定点整合已获得乐成，而在动物中除了叶绿体表白载体可实现定点整合以外，细胞核转化中还很常见乐成的报导。
4 构建叶绿体表白载体
为了战败细胞核转化中常常出现的外源基因表白功率低，方位效应及因为核基因随花粉疏散而带来的不平安性等成绩，近几年出现的一种旧式的遗传转化技术--叶绿体转化，正以它的优胜性和发展前景日益为人们所晓得并遭到重视。到此刻为止，已在烟草、水稻、拟南芥、马铃薯和油菜（侯丙凯等，等颁布发表）5莳植物中接踵实现了叶绿体转化，使得这一转化技术初步成为动物基因工程中新的生长点。
因为此刻多莳植物的叶绿体基因组全序列已被测定，这就为外源基因经由同源重组机拟定点整合进叶绿体基因组奠基了基础，此刻构建的叶绿体表白载体底子上都归于定点整合载体。构建叶绿体表白载体底子上都归于定点案例载体。构建叶绿体表白载体时，普通都在外源基因表白盒的双方各跟尾一段叶绿体的DNA序列，称为同源重组片断或定位片断（Targeting fragment）。当载体被导入叶绿体后，经由这两个片断与叶绿体基因组上的雷同片断产生同源重组，就大概将外源基因整合到叶绿体基因组的特定位点。在以作物改良为用意的叶绿体转化中，要求同源重组产生从此，外源基因的刺进既不惹起叶绿体基因原有序列丢失，又不致于败坏刺进点处原有基因的服从。为满足这一要求，已有的功课都选用了相邻的两个基因作为同源重组片断，比方rbcL/accD，16StrnV/rpsl2rps7,psbA/trnK,rps7/ndhB。当同源重组产生从此，外源基因定点刺进在两个相邻基因的间隔区，确保了原有基因的服从不受影响。比来，Daniel等使用烟草叶绿体基因trnA和trnI作为同源重组片断，构建了一种通用载体（universal vector）。因为trnA和trnI的DNA序列在高档动物中是高度留存的，作者认为这种载体可用于多种差别动物的叶绿体转化。假设这种载体的通用性失去证实，那么这项功课无疑为构建便当而有效的旧式叶绿体表白载体供应了一个好的思绪。
因为叶绿体基因组的高复制性，定点整合进叶绿体基因组的外源基因每每会失去高功率表白，比方McBride等人首次将Bt CryIA(c)毒素基因转入烟草叶绿体，Bt毒素卵白的表白量高达叶子总卵白的3%～5%，而普通的核转化技术只能达到0.001%～0.6%。比来，Kota等将Bt Cry2Aa2卵白基因转入烟草转入烟草叶绿体，也发明毒卵白在烟草叶子中的表白量很高，占可溶性卵白的2%～3%，比细胞核转化超出跨越20～30倍，转基因烟草不仅能抗活络虫豸，而且可能百分之百地杀去世那些产生了高抗性的虫豸。Staub等比来报导，将人的生长激素基因转入烟草叶绿体，其表白量竟高达叶片总卵白的7%，比细胞核转化超出跨越300倍。这些实验充沛说明，叶绿体表白载体的构建和转化，是实现外源基因高效表白的紧张路子之一。
5 定位旌旗灯号的使用
上述几种载体优化策略主要用意是提高外源基因的转录和翻译功率，然则，高程度表白的外源卵白可否在动物细胞内平稳存在以及积累量的几何是动物遗传转化中需要思索的另一紧张成绩。
近几年的研究发明，假设某些外源基因跟尾上适当的定位旌旗灯号序列，使外源卵白产生后定向运输到细胞内的特定部位，比方：叶绿体、内质网、液泡等，则可光鲜明显提高外源卵白的平稳性和累积量。这是因为内质网等特定地区为某些外源卵白供应了一个绝对平稳的内情况，有效防止了外源卵白的降解。比方，Wong等将拟南芥rbcS亚基的转运肽序列跟尾于杀虫卵白基因之前，发明杀虫卵白可能特同性地积累在转基因烟草的叶绿体内，外源卵白总的积累量比比较提高了10～20倍。比来，叶梁、宋艳茹等也将rbcS亚基的转运肽序列跟尾于PHB构成相干基因之前，希图使基因表白产物在转基因油菜种子的质体中积累，而后提高外源卵白含量。其它，Wandelt等和Schouten等将内质网定位序列（四肽KDEL的编码序列）与外源卵白基因相跟尾，发明外源卵白在转基因动物中的含量有了光鲜明显提高。光鲜明显，定位旌旗灯号对于促成卵白质积累有生动结果，但统一种定位旌旗灯号能否合用于所有的卵白另有待于进一步确认。
6 内含子在加强基因表白方面的使用
内含子加强基因表白的结果起头是由Callis等在转基因玉米中发明的，玉米乙醇脱氢酶基因（Adhl）的榜首个内含子（intron 1）对外源基因表白有光鲜明显加强结果，该基因的其余内含子（比方intron8,intron9）也有肯定的加强结果。厥后，Vasil等也发明玉米的果糖构成酶基因的榜首个内含子能使CAT表白程度提高10倍。水稻肌动卵白基因的第三个内含子也能使报导基因的表白程度提高2～6倍。至今对内含子加强基因表白的机制不不分明，但普通认为大概是内含子的存在加强了mRNA的加工功率和mRNA平稳性。Tanaka等人的多项研究表明，内含子对基因表白的加强结果主要产生在票据叶动物，在双子叶动物中不光鲜明显。
因为内含子对基因表白有加强结果，Mcelroy等在构建票据叶动物表白载体时，特地将水稻的肌动卵白基因的榜首个内含子保存在该基因启动子的下贱。雷同，Christensen等在构建载体时将玉米Ubiquitin基因的榜首个内含子置于启动子下贱，以加强外源基因在票据叶动物中的表白。然则，有研究指出，特定内含子对基因表白的促成结果取决于启动子强度、细胞范例、用意基因序列等多种因素，以致偶然会取决于内含子在载体上的方位。比方，玉米Adhl基因的内含子9置于Gus基因的5‘端，在CaMV35S启动子调控下，Gus基因的表白未见加强；当把内含子置于Gus基因3端，在雷同的启动子操控下，Gus基因的表白程度却减少了约莫3倍。由此可见，内含子对基因表白的结果机制大概是很混乱的，如何使用内含子构建高效动物表白载体，此刻还贫乏一个牢固的方法，值得进一步会商。
7 多基因策略
迄今为止，多数的遗传转化研究都是将繁多的外源基因转入受体动物。但偶然因为单基因表白强度不可或结果机制繁多，尚不克不及获得志向的转基因动物。假设把两个或两个以上的能起协同结果的基因一路转入动物，将会获得比单基因转化更为志向的效果。这一策略在培育种植提拔抗病、抗虫等抗逆性转基因动物方面已失去使用。比方，根据抗虫基因的抗虫谱及结果机制的差别，可遴选两个服从互补的基因停止载体构建，并经由肯定办法将两个抗虫基因一路转入一个动物中去。王伟等将外源凝聚素基因和卵白酶按捺剂基因一路转入棉花，失去了含双价抗虫基因的转化植株。Barton等将Bt杀虫卵白基因和蝎毒素基因一路转入烟草，其抗虫性和防止益虫产生抗性的才干年夜为提高（专利）。在抗病方面，本实验室蓝海燕等构建了包括β-1，3-葡聚糖酶基因及几丁质酶基因的双价动物表白载体，并将其导入油菜和棉花，效果表明，转基因植株均产生了光鲜明显的抗病性。比来，冯道荣、李宝健等将2～3个抗真菌病基因和hpt基因连在一个载体上，两个抗虫基因与bar基因连在另一个载体上，用基因枪将它们一路导入水稻植株中，效果表明，70%的R。代植株含有导入的全部外源基因（6～7个），且导入的多个外源基因趋势于整合在基因组的一个或两个位点。
普通老例的转化，尚不克不及将年夜于25kb的外源DNA片断导入动物细胞。而一些服从相干的基因，譬喻动物中的数目性状基因、抗病基因等，年夜多成"基因簇"的方法存在。假设将某些年夜于100kb的年夜片断DNA，如动物染色体中人造存在的基因簇或并不相连锁的一系列外源基因导入动物基因组的统一位点，那么将有大概出现由多基因操控的优良性状或产生广谱的抗虫性、抗病性等，还可能付与受体细胞一种全新的代谢路子，产生新的生物分子。不仅云云，年夜片断基因群或基因簇的同步刺进还可能在肯定水平上战败转基因带来的方位效应，增添基因默然平静等不良景象的产生。比来，美国的Hamilton和我国的刘耀光分别开辟出了新一代载体体系，即具备克隆年夜片断DNA和借助于农杆菌介导间接将其转化动物的BIBAC和TAC。这两种载体不仅可能放慢基因的图位克隆，而且对于实现多基因操控的种类改良也会有潜伏的使用代价。此刻，对于BIBAC和TAC载体在多基因转化方面的使用研究还方才初步。
8 遴选标记基因的使用和删去
遴选标记基因是指在遗传转化中可能使转化细胞（或一般）从许多的非转化细胞中遴选进去的标记基因。它们普通可能使转基因细胞产生对某种遴选剂具备抗性的产物，而后使转基因细胞在减少这种遴选的培育种植提拔基上失常生长，而非转基因细胞因为贫乏抗性则表现出对此遴选剂的活络性，不克不及生长、发育和合成。在构建载体时，遴选标记基因跟尾在用意基因一旁，两者各有本人的基因调控序列（如启动子、停止子等）。此刻罕用的遴选标记基因主要有两年夜类：抗生素抗性酶基因和除草剂抗性酶基因。前者可产生对某种抗生素的抗性，后者可产生对除草剂的抗性。使用最多的抗生素抗性酶基因包括NPTII基因（产生新霉素磷酸转移酶，抗卡那霉素）、HPT基因（产生潮霉素磷酸转移酶，抗潮霉素）和Gent基因（抗庆年夜霉素）等。罕用的抗除草剂基因包括EPSP基因（产生5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶，抗草甘磷）、GOX基因（产生草甘膦氧化酶、降解草甘膦）、bar基因（产生PPT乙酰转移酶，抗Bialaphos或glufosinate）等。
下面这些当中1、2、3、5、6都是值得留意的，特地是5，因为你要向细胞外渗出。骨架载体可能遴选PB I121，而后你可能在下面改变基因型。
后边的即是克隆的进程了，绝对简单。
1 主要获得用意基因加酶切位点，连入改好的载体中。
2 将质粒转入年夜肠杆菌DH5a扩增
3 将扩增好的质粒转入动物细胞内停止表白
4 收集根细胞外培育种植提拔基检测能否有该卵白的表白和渗出。
至于改革载体那几个进程要是答题的话简单说说就可能了，到底假设真的做出一个好载体都可能本人开公司了。
广东产业年夜学研究生导师张海燕如何样
张海燕传授
材料能源学院2014-6-16 16:08:24
1.教诲与研究经历：
1978-1982，中山年夜学半导体物理业余，学士学位。
1995-1998，中山年夜学凝结态物理业余，博士学位。
2007，法国南特年夜学，拜访学者。
2.研究标的目的：
超等电容器;
锂离子电池;
染料敏化太阳能电池;
镍氢电池;
纳米复合导热材料;
纳米电磁波吸取和屏障材料;
3.职务、兼职和荣誉称呼：
广东产业年夜学传授、博导；
我国材料研究学会理事，
广东省材料研究学会副理事长，
广东省学位委员会学科评断构成员；
广东省能源电池及太阳能转化与储存材料工程技术研究开辟核心主任；
广东省教诲厅服从材料的制备与使用技术要点实验室主任。
4.主持的主要名目：
(1)国度人造迷信基金名目：纳米碳-金属核壳型布局颗粒复合材料的热传导个性及其机理研究（51276044），2013.1-2016.12
(2) 国度人造迷信基金名目:依据高导热，高化学平稳，低密度纳米碳热界面材料的制备及其导热功用研究(No. 20971027)，2010.1-2012.12
(3) 国度人造迷信基金名目《碳包纳米晶的构成、布局与功用研究》 (No.50372013) 2004.1-2006.12
(4)国度人造迷信基金对外相同与合作名目《碳包金属纳米晶导热材料的研究》 (2006国科金工外资助字第50610105054) 2006.8-2007.8
(5)国度863方案名目：激光旧式加工工艺技术与装备（2012AA040210）（2012.12-2014.12）(合作)
(6) 国度863方案名目《恶性肿瘤靶向性纳米药物载体及其使用的研究》 (No.2003BA310A24) 2004.1-2006.12 (合作)
(7)国度科技撑持方案课题，疾速检测技术及电动汽车相干产物和材料检检验证技术研究与演示，2012BAK26B04，2012.10-2014.12(合作)
(8)教诲部高档黉舍博士学科点专项科研基金《一种全新的磁性靶向药物载体---碳包铁纳米晶的研究》 (No.20050562002) 2006.1-2007.12
(9)教诲部高档黉舍博士学科点专项科研基金”高功用纳米碳及其复合材料热传导举动的研究” 20094420110005，2010.1-2012.12
(10)广东省天下合作名目:电磁波材料和东西检测及使用技术结合研究核心的建立（No.2011B050300017) 2011.10-2013.12
(11)广东省工程技术研究开辟核心名目:能源电池及太阳能转化与储存材料2012B070800015，2012.10-2014.12
(12)广东省省部产学研企业科技特派员功课站建立名目:广东信力特种橡胶成品无限公司企业科技特派员功课站(名目编号：2011B090600001)（2011.10-2014.3）
(13)广东省人造迷信基金要点名目“高功用纳米碳及其复合材料热传导举动的研究”（No.9251009001000006) 2010.1-2012.12
(14)广东省人造迷信基金名目《兼具磁场靶向化疗和发烧个性的纳米铁碳复合材料的研究》,（No.07001769) 2008.1-2009.12
(15) 广东省教诲部产学研联合名目“ LED照明散热要害技术的集成开辟及其家产化” （No.2009B090300017）2009.10-2011.12(合作)
(16)广东省科技方案名目“纳米碳材料在染料敏化太阳能电池对电极中的使用技术”(名目编号：2009B011100006) 2009.10-2011.12
(17) 广东省教诲部产学研合作严峻专项“高功用钛酸锂储能电池的要害技术及其家产化” （No.2010A090200063） 2010.12-2013.12(合作)
(18)广东省高档黉舍科技创新要点名目：锂离子能源电池纳米复合电极材料的研究， (名目编号：12ZK0088), 2012.1-2014.12
(19) 广东省高新技术家产开辟区发展疏导专项资金方案名目“高功用磷酸铁锂能源电池和高效钛酸锂储能电池研制和家产化” （No.2010A011300041），2011.1-2014.12(合作)
(20)广州市科技方案名目《高功用取向碳纳米管及其复合材料超等电容器的研究》2009.10-2011.12
5.获奖情况：
1． “碳C60相干材料的研究” 1999年获广东省人造迷信奖二等奖（排名第二）
2． “碳纳米材料储氢技术的研究与使用” 2006年获广东省迷信技术奖三等奖（排名榜首）
3． “碳纳米材料的研究” 2002年获广州市迷信技术奖二等奖（排名榜首）
4． “依据年夜功率二次电池用碳纳米复合电极的充放电功用研究与使用”2008年获广东省迷信技术奖三等奖（排名榜首）
5．“依据年夜功率镍氢电池用碳纳米复合电极的充放电功用研究与使用”2007年获广州市迷信技术奖三等奖（排名榜首）
7．“旧式电磁波吸取和屏障材料要害技术的研究与使用"2009年获广东省迷信技术奖三等奖（排名榜首）
8．“高功用电磁屏障导电橡胶要害技术的研制及家产化” 2010年获东莞市迷信技术奖二等奖（排名第二）
9. “高功用导热橡胶要害技术的研制及家产化”2011年获东莞市迷信技术奖二等奖（排名第二）
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